相襯顯微鏡（簡(jiǎn)介）
第一節(jié) 相襯顯微鏡(Phase contrast microscope)
在光學(xué)顯微鏡的改進(jìn)過程中，相襯顯微鏡的制造成功和普遍的應(yīng)用，是近代顯微鏡技術(shù)中的重要成就。在1935年荷蘭學(xué)者澤尼克提出了相襯法原理，至1941年由德國(guó)蔡司工廠誕生了世界上第一臺(tái)相襯顯微鏡。它的產(chǎn)生，使人類的視覺在光學(xué)顯微鏡下又得到新的擴(kuò)展。從信息利用的角度來看，人們將它視為光學(xué)信息處理概念下的第一個(gè)產(chǎn)品，因而獲得了1953年諾貝爾獎(jiǎng)金。
我們知道，人眼只能在光波的波長(zhǎng)（顏色）和振幅（亮度）有變化的情況下，才能在顯微鏡下看到被檢物體的存在，但活的生物體多是無色透明的，當(dāng)光線通過時(shí)，波長(zhǎng)和振幅變化不顯著，這樣在明場(chǎng)鏡檢下就難于觀察清晰。為了克服這一困難，可以采用一定的措施，如物理、化學(xué)處理法、材料經(jīng)固定、染色等過程，使被檢物體的顏色及亮度發(fā)生變化，但這只能觀察已被殺死的材料，而不能觀察到活體狀態(tài)；當(dāng)然，縮小聚光鏡的孔徑光闌，以增加明暗反差的對(duì)比，但這樣不能充分發(fā)揮物鏡數(shù)值孔徑的性能，細(xì)微結(jié)構(gòu)仍難于被分辨，同時(shí)鏡象亮度也隨之降低；利用暗場(chǎng)、熒光或偏光鏡檢術(shù)，雖然能觀察活體標(biāo)本，但這些顯微術(shù)都是利用不同的光學(xué)原理，達(dá)到特定的觀察目的，鏡檢效果局限在一定范圍內(nèi)?？梢娚鲜龃胧┒疾荒艿玫綕M意的鏡檢效果，而采用相襯顯微術(shù)，則能解決上述問題，使無色透明活體標(biāo)本的細(xì)微結(jié)構(gòu)在相襯顯微鏡下變得清晰可見。
一、相襯顯微鏡的特點(diǎn)（蔡康光學(xué) http://www.shkon.com.cn)
相襯顯微鏡是利用被檢物體的光程（折射率與厚度之乘積）之差進(jìn)行鏡檢的方法。也即是有效地利用光的干涉現(xiàn)象，將人眼不可分辨的相位差變?yōu)榭煞直娴恼穹?，即使是無色透明的物質(zhì)亦成為清晰可見，這是普通顯微鏡難以達(dá)到的。這不僅大為便利了活體材料的觀察，而且相襯顯微術(shù)和
普通染色觀察相結(jié)合，還可判斷“膺象”和真實(shí)的圖象。
相位和相位差
光的傳播具有波動(dòng)性質(zhì)，波動(dòng)的能以平衡位置為準(zhǔn)，以一定的振幅反復(fù)振動(dòng)而前進(jìn)。光波通過光學(xué)均勻體時(shí)， 單位時(shí)間（T）內(nèi)波動(dòng)的能所達(dá)到的位置，便是它的“相位”。
如圖4-2所示，有A、B兩束光，其中A光束只經(jīng)過單一介質(zhì)（如空氣）；而B光束在中途還通過一塊透明玻璃，這樣B光束使受到阻滯而速度減少。因此，A和B之間便產(chǎn)生了一定的相位差。
相位差和振幅差示意圖
圖4-2
在一定的介質(zhì)內(nèi)，波長(zhǎng)決定了可見光的顏色，而振幅的大小則決定其亮度，這是為人眼所能分辨出的，但人眼不能分辨出相位差。因此，在普通顯微鏡下觀察未經(jīng)固定、染色的無色透明材料時(shí)，雖然被檢物體各部分的折射率不同，并能使通過它的各組光線產(chǎn)生一定的相位差，也不能察覺出它們之間的差異，就是這個(gè)道理。圖中的A光束和通過具有吸光物質(zhì)的C光束之間，由于振幅的減少，使亮度減弱，則和A光束有著明暗的差別，這樣就能為人眼所分辨。
光源射出的光線通過被檢物體時(shí)，如果某部分完全是均質(zhì)透明體，則光線將繼續(xù)前進(jìn)，稱直射光；若某部分含有折射率或厚度不同的均質(zhì)時(shí)，由于光的衍射現(xiàn)象則向周圍側(cè)方分散前進(jìn)，這種光線稱為衍射光。當(dāng)直射光和衍射光兩個(gè)光波達(dá)到一點(diǎn)時(shí)，則相互干涉，形成合成波。合成波的大小，取決于兩個(gè)光波的振幅和相位差。如果振幅相等，相差為零，其合成波則有兩倍的振幅，產(chǎn)生相長(zhǎng)干涉（同向量），最為明亮；若一個(gè)光的相位推遲，其合成波減少，光度漸暗，當(dāng)恰好推遲到半個(gè)波長(zhǎng)（1/2λ）時(shí)，則兩個(gè)光波相互抵消，合成波發(fā)生相消干涉（異向量），則成為黑暗狀態(tài)。
二、相襯顯微鏡的裝置
相襯顯微鏡因各廠家的制作形式不同，用法也略有各異，但其原理是相同的，在裝置上都包括有：環(huán)狀光闌、相板、中心（合軸）調(diào)整望遠(yuǎn)鏡。（蔡康光學(xué) http://www.shkon.com.cn)
（一）環(huán)狀光闌(Ring slit)：裝在聚光鏡的下方，而與聚光鏡組合為一整體——相襯聚光鏡。它
是由大小不同環(huán)形光闌裝在一圓盤內(nèi)，外面標(biāo)有10×、20×、40×、100×字樣，相應(yīng)地與不同倍率的物鏡配合使用。老式的常為單一環(huán)狀光闌，附加在視場(chǎng)光闌的上部，它的大小依聚光鏡下面安裝的調(diào)節(jié)透鏡來進(jìn)行調(diào)節(jié)。
（二）相板(Phase plate)：在物鏡的后焦點(diǎn)平面處裝有相板，它分為兩部分，一是通過直射光的部分，為半透明的環(huán)狀，叫“共軛面”；另一是通過衍射光的部分，叫“補(bǔ)償面”有相板的物鏡稱“相襯物鏡”，外殼上常有“PH”字樣。
相板上鍍有兩種不同的膜——吸收膜和相位膜，吸收膜常為鉻、銀等金屬在其真空中蒸發(fā)而鍍成的薄膜，能把通過它的光線吸收60~93%，可分為透過率為7%、15%、20%、40%四個(gè)檔級(jí)。因此，分高（HIGH略寫H）、中（Medium略寫M）、低（Low略寫 L）及低低（Low-Low略寫LL）四類。這樣可根據(jù)被檢物體的特性而加以選擇應(yīng)用?，F(xiàn)將相襯物鏡的選擇方法列表于下。
負(fù)相襯Negative contrast (N) 正相襯Positive contrast(P) 適用于物體的形態(tài)、數(shù)量及活體情況的觀察 適用于物質(zhì)內(nèi)部細(xì)微結(jié)構(gòu)的觀察，同時(shí)也用于形態(tài)、數(shù)量和活體的觀察 負(fù)高(NH) 負(fù)中(NM) 正低(PL) 正低低(PLL) 適用于折射率比較弱的被檢物體 適用于折射率比較強(qiáng)的被檢物體 適用于折射率比較弱的被檢物體 適用于折射率比較強(qiáng)的被檢物體 相位膜常為氟化鎂等在真空中蒸發(fā)成的薄膜，通過它的光線，相位被推遲，通常多為推遲1/4波長(zhǎng)的相位膜，但有時(shí)因明暗反差過強(qiáng)，使鏡檢效果降低，而鍍有推遲1/3波長(zhǎng)的相位膜。
相板的構(gòu)造通常多為吸收直射光的類型，可分為負(fù)相襯(Negative contrast略N)和正相襯（Plosive contrast略寫P）兩類。
（三）中心（合軸）調(diào)整望遠(yuǎn)鏡，它實(shí)際是長(zhǎng)工作距離，放大倍率約4~5的放大鏡，用以調(diào)整環(huán)狀光闌所造成的象與相板共軛面完全吻合。否則應(yīng)被吸收的直射光被泄掉；對(duì)不該吸收的衍射光反被吸收；應(yīng)推遲相位的部分有的不能被推遲，這樣就不能達(dá)到相襯鏡檢的效果。為了避免上述情況，必須使環(huán)狀光闌的中心與物鏡的光軸完全在一直線上才能使兩者吻合。當(dāng)然在取下目鏡后，在鏡筒內(nèi)也能看到兩者的象，但因象很小，很難調(diào)節(jié)，利用中心調(diào)整望遠(yuǎn)鏡安裝在鏡筒上加以放大而便于調(diào)節(jié)。
三、相襯鏡檢的原理（蔡康光學(xué) http://www.shkon.com.cn)
鏡檢時(shí)，光源只能通過環(huán)狀光闌的透明環(huán)，經(jīng)聚光鏡后，這束光線通過被檢物體，因各部分的光程不同，光線將發(fā)生不同程度的偏斜（衍射）。由于透明圓環(huán)所成的象恰恰落在物鏡后焦點(diǎn)平面上，并和相板的共軛面重合。因此，未偏斜的直射光便通過共軛面；而發(fā)生偏斜的衍射光則由補(bǔ)償面通過。由于相板的共軛面與補(bǔ)償面的性質(zhì)不同，它們分別將通過這兩部分的光線產(chǎn)生一定的相位差和強(qiáng)度的減弱，這樣兩組光線再經(jīng)后透鏡的會(huì)聚，又復(fù)在同一光路上行進(jìn)，而使直射光和衍射光產(chǎn)生光的干涉，變相位差為振幅差。干涉的結(jié)果，有的是振幅的同向量，合成波增大，即相長(zhǎng)干涉，此部分便明亮；有的是振幅的異向量，合成波減少，即相消干涉，則此部分便暗淡。這樣在相襯鏡檢
時(shí)，通過無色透明物體的光線，使人眼不可分辨的相位差轉(zhuǎn)變?yōu)槿搜劭煞直娴恼穹睢?/p>
